Recherche de la nitrate réductase

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La nitrate réductase est une enzyme (un complexe enzymatique en réalité) qui est capable de catalyser la réaction de réduction des nitrates ( $NO_3^-$ ).

[modifier] Principe

Cette enzyme est recherchée en bactériologie systématique, il existe plusieurs type de nitrate réductase :

La nitrate réductase capable de réduire les nitrates jusqu'au stade nitrites selon $NO_3^- + 2 H^+ + 2 e^- \longrightarrow NO_2^- + H_2O$ ;
la nitrate réductase capable de réduire les nitrates jusqu'au stade diazote (gazeux) selon $NO_3^- + 6 H^+ + 5 e^- \longrightarrow N_2 + 3 H_2O$ ;
la nitrate réductase capable de réduire les nitrates en ammoniac ou ammonium selon $NO_3^- + 9 H^+ + 8 e^- \longrightarrow NH_3 + 3 H_2O$ --A VERIFIER --

[modifier] Mise en évidence

[modifier] Principe

Le réactif de Griess prend une teinte rouge en présence d'ions nitrites. L'apparition de cette teinte dans le milieu signe la présence d'ions nitrites. Cela signifie que la bactérie posséde une nitrate réductase et que cette dernière est capable de réduire les nitrates jusqu'au stade nitrites : c'est le cas pour les Entérobactéries.

En revanche, l'absence de coloration rouge ne signifie pas que la bactérie étudiée ne possède pas de nitrate réductase. En effet, on a vu qu'il était possible qu'une bactérie possède une nitrate réductase très active et capable de réduire les nitrates jusqu'au stade diazote. Une bactérie possédant une tel enzyme consommera la totalité des nitrates du milieu. Nous devons vérifier s'il reste des ions nitrates dans le milieu ou non.

Pour ce faire, il faut utiliser un composé capable de réduire les ions nitrates en ions nitrites comme la poudre de zinc. Cette dernière est alors ajoutée au milieu après après l'ajout du réactif de Greiss. Après quelques minutes, si l'on observe l'apparition d'une teinte rouge c'est qu'il y a eu formation d'ions nitrites par l'action du zinc. Il restait donc des ions nitrates dans le milieu, la bactérie ne possède pas de nitrate réductase. A l'inverse, si l'on observe pas de coloration rouge, c'est qu'il n'y avait plus d'ions nitrates dans le milieu pour réagir avec le zinc. La bactérie, avec sa nitrate réductase très active a consommé tout les ions nitrates.

Remarque : l'utilisation des nitrates jusqu'au stade diazote pour une bactérie aérobie stricte comme Pseudomonas lui permet de cultiver en anaérobiose dans un milieu contenant des nitrates (culture de haut en bas du tube d'un milieu viande-foie nitraté par exemple).

[modifier] Technique

On utilise un milieu nitraté (bouillon nitraté, Mannitol-Mobilité-Nitrate). La capsule GLU de la galerie API 20 E est également utilisable.

Après incubation (culture visible), ajouter:

Du réactif de Griess (2 gouttes)
Ou une goutte de réactifs :
- réactif Nitrites 1 (acide sulfanilique),
- réactif Nitrites 2 (α-naphtylamine).

Le réactif de Greiss est un mélange des réactifs nitrites 1 & 2.

[modifier] Lecture

Nitrate réductase : Résultats possible du test

A Milieu rouge orangé : la bactérie possède l’enzyme nitrate réductase au stade $NO_2^-$
B Milieu jaune => ajout de la poudre de zinc
- C Milieu rouge : présence de nitrate dans le milieu → la bactérie ne possède pas l’enzyme.
- D Coloration jaune : pas de nitrate dans le milieu → la bactérie possède l’enzyme au stade N₂.