Souris knock-out

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Les souris knock-out sont des souris domestiques (Mus musculus) qui ont été génétiquement modifiées par une procédure dite de knock-out, qui consiste à modifier les gènes dans les cellules souches embryonnaires dont elles sont issues. Ces cellules souches étant pluripotentes, elles sont donc toutes identiques. Il faut distinguer le Knock-Out d'une simple recherche de mutants. Le Knock-Out est une mutagenèse ciblée dans la mesure où elle n'altère que la séquence du gène étudié. Cette méthode se distingue des manipulations sur des animaux transgéniques, lesquels sont plutôt soumis à l'ajout d'un gène.

Souris Knockout

Sommaire

1 Intérêt de cette procédure
2 Etapes du protocole
3 Perspectives
4 Voir aussi
- 4.1 Articles connexes
- 4.2 Lien externe

[modifier] Intérêt de cette procédure

Il est particulièrement intéressant, pour les biologistes s'intéressant au rôle d'un gène particulier, de "supprimer" celui-ci afin d'observer les conséquences physiologiques et cytologiques d'une telle suppression. Le but de la procédure de knock-out est donc d'étudier les effets d'un gène sur un organisme entier par son absence ou par son absence de fonctionnement, par exemple pour l'essai de médicaments thérapeutiques.

[modifier] Etapes du protocole

Le protocole visant à mettre au point une souris Knock-Out suit un déroulement précis. Tout d'abord il faut disposer de la séquence du gène que l'on veut supprimer. Celle-ci nous permettra de construire un plasmide approprié s'insérant par recombinaison homologue et de manière spécifique dans le génôme de l'organisme cible, c'est-à-dire au locus précis du gène à supprimer.

Cette procédure est donc effectuée sur une cellule-souche de l'embryon (entre les stades blastula-morula, de 8 à 64 cellules) que l'on prélève, que l'on cultive, et que l'on ré-agrège à l'embryon ensuite. L'organisme obtenu sera donc un organisme mosaïque dans le sens où toutes ses cellules n'auront pas le même génome pour le gène considéré.

La seconde étape du processus consiste à réaliser un croisement entre ces individus appelés G0 et un individu de phénotype "sauvage". Les individus G1 issus de ce croisement n'hériterons du gène inactivé que dans le cas où la (ou les) cellule souche modifiée touchait la lignée germinale des G0. Dans ce cas assez rare, 50% des individus G1 seront hétérozygotes (KO/Sauvage) pour le gène considéré. Afin d'obtenir des homozygotes KO/KO (but de l'expérience), il faut croiser entre eux ces individus G1 entre eux, et l'on observera alors 25% d'individu G2 homozygotes KO/KO. Par comparaison avec un groupe témoin, on peut alors procéder à l'étude fonctionnelle de ces souris KO, qui ont deux copies inactives (en réalité doublement délétées) pour le gène d'intérêt.

Enfin, ce protocole nécessite de pouvoir cribler les cellules possédant un exemplaire KO du gène. Le plus souvent, on incorpore au plasmide, entre les deux séquences homologues du gène cible, un gène étranger de résistance à un agent délétère (par exemple la néomycine).

Sans entrer dans les subtilités du protocole, notons aussi qu'il faut pouvoir sélectionner les individus chez qui seule la séquence homologue entre plasmide et gène cible a été insérée (double crossing-over nécessaire), ce qui est rendu possible par l'incorporation dans une autre région du plasmide d'un gène étranger de sensibilité à un agent délétère (qui permettra de cribler les cellules ayant incorporé le plasmide entier, et donc de les supprimer).

[modifier] Perspectives

Cette méthode nécessite plusieurs mois et coûte très chers aux laboratoires, amenant ainsi la création de laboratoires commerciaux exclusivement spécialisés pour concevoir ces animaux expérimentaux.

Précisons également que les souris ne sont pas les seuls organismes pouvant faire l'objet d'un knock-out : tout organisme, potentiellement, peut voir l'un de ses gènes inactivé par cette technique.